传感器法检测甲萘威残留的研究

2008-02-27 10:55:55来源: www.eccn.com

  张淑平,单联刚,经媛元,施利毅

  (1.上海理工大学 城市建设与环境工程学院,上海 200093;

  2.上海水产大学 食品学院,上海 200090;3.上海大学,上海 200436)

  1 引言

  近年来食品安全越来越引起世界各国的重视,对食品中农药残留的快速检测一直是食品卫生科学领域的研究重点,而且具有重要的临床诊断价值。有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的常用检测手段是色谱法、色谱一质谱联用法和波谱法。这些方法虽然结果准确,但都具有仪器复杂、价格昂贵、操作繁琐等问题,而且常常需要液-液萃取或固-液萃取等繁琐的前期处理过程,不能满足现场快速检测的需要。随着近代电子技术和生物工程的快速发展,生物传感器越来越受到学者们的关注。生物传感器由于其具有生物反应的快速、高特异性、高灵敏度的特点,为农药残留速测问题的解决提供了一种新的方法。

  胆碱酯酶电流型生物传感器工作原理:底物氯化乙酰硫代胆碱在胆碱酯酶的催化作用下可以水解为乙酸和巯基胆碱,巯基胆碱具有电活性,在外加一定电势的前提下,可在Pt、玻碳等基础电极表面氧化,所产生的氧化电流强度可反映出它在电极表面的浓度。当胆碱酯酶被农药抑制时,该氧化电流的大小能准确地反应酶被抑制的程度,从而检测出农药残留的浓度。

  2 主要试剂与仪器

  乙酰胆碱酯酶(AChE,来自电鳗,Sigma),氯化乙酰硫代胆碱(ATChCl,Sigma),牛血清白蛋白(BSA,上海伯奥生物科技有限公司),戊二醛(25%水溶液,上海凌锋化学试剂有限公司),尼龙微孔滤膜、硝酸纤维素微孔滤膜、醋酸纤维素微孔滤膜(孔径均为0.45μm,上海半岛实业有限公司净化器材厂),其他试剂均为分析纯,溶液均用去离子水配制。CHI800电化学分析仪(工作电极为玻碳电极,参比电极为饱和甘汞电极,对电极为铂电极,上海辰华仪器公司)

  3 实验结果与讨论

  3.1 酶促反应的电化学检测

  实验中的工作电极是玻碳电极,将玻碳电极用0.3 μm的Al2O3悬浊液在麂皮上抛光至形成镜面,用去离子水清洗后,在0.50 mol?L-1H2SO4溶液中用循环伏安法活化,扫描范围0~1.0 V,反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。用准备好的玻碳电极来检测酶促反应的特点。

  以pH7.40、浓度0.10 mol?L-1的Na2 HPO4-KH2PO4磷酸缓冲溶液为支持电解质,加入10.0μL酶液催化反应90 s后,以100 mV?s-1的扫速在0~1.0 V区间进行循环伏安扫描。然后加入0.50 mL,0.01 mol?L-1氯化乙酰硫代胆碱(ATChCl)相同条件下进行扫描。

  如图1所示,在没有加酶的底物溶液中进行循环伏安扫描时没有出现峰(曲线a),当加入10.0μL酶液,酶催化反应产物硫代胆碱在电位大约为0.70 V处出现明显的氧化峰(曲线b)。而阴极化扫描无峰,表明电极反应不可逆。由此可见,硫代胆碱在玻碳电极表面的氧化是一个不可逆过程。利用硫代胆碱的这种性质可以研制生物传感器,实现农药的检测。

  

  

  3.2 游离酶活力与峰电流的关系

  在9.50 mL pH为7.40的磷酸缓冲溶液中,分别加入2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μL浓度为0.10 u/μL的酶溶液,然后各加入0.50 mL 0.01 mol?L-1氯化乙酰硫代胆碱(ATChCl),在20℃下催化反应90 s后,在三电极系统中进行线性伏安扫描,分别记录氧化峰电流。由图2可知,氧化峰电流的大小与酶活力大小显著相关,线性相关系数达0.9964。

  

  

  3.3 胆碱酯酶的固定化

  选择AChE的固定化条件的实验中,分别取一定量的浓度0.10 U/μL的AChE溶液、不同浓度的BSA和戊二醛溶液于0.5 mL的离心管中,在旋涡混合器上混匀后,将10片直径为6 mm的微孔滤膜片浸入混合酶溶液中,在4℃下进行固定化。8 h后将酶片取出,用pH 8.00的磷酸缓冲液反复清洗,常温下干燥。测定酶活力时,将直径为6 mm固定化酶片利用橡胶管固定在玻碳电极的表面,使酶片紧贴电极表面,形成酶电极作为工作电极,与Ag/AgCl参比电极和铂对电极构成三电极检测系统。

  首先,对固定化载体进行筛选。载体的物理和化学性质直接影响固定化酶片的活力。本试验从孔径均为0.45μm硝酸纤维素微孔滤膜、尼龙微孔滤膜、醋酸纤维素微孔滤膜三种最通用的商品载体膜中筛选出最适宜的载体。依次取10.0 U胆碱酯酶(AChE)、30.0μL 1.0%的BSA、10.0μL 5.0%的戊二醛溶液于0.50 mL的离心管中,旋涡混合器上混匀。分别固定在硝酸纤维素滤膜片、醋酸纤维素滤膜片、尼龙滤膜片上,4℃下固定8 h。固定好后将酶片取出冲洗、常温下干燥后,测定酶活力以选择酶的固定载体。经过多次实验,如图3所示,尼龙微孔滤膜和醋酸纤维素微孔滤膜作为固定化载体所固定的酶片活力低,且在操作过程中容易破损,因而不予选用。而以硝酸纤维素微孔滤膜作为固定化载体所制成的固定化酶片酶活力高、重现性好、机械强度高,从而作为本实验的固定化载体。

  

  

  其次,对固定化酶液浓度进行选择。分别取25.0,50.0,75.0,100.0,125.0,150.0μL的0.10U/μL AChE溶液、30.0μL1.0%的BSA、10.0μI。5.0%的戊二醛于0.5 mL的离心管中,加入磷酸缓冲液至刻度,旋涡混合器上混匀。将10片直径为6mm的硝酸纤维素微孔滤膜片浸入混合酶溶液中,4℃固定8 h。固定好后将酶片取出、常温下干燥后,确定固定化酶液的浓度。由图4可见,当固定化酶液浓度在20 U/mL以下时,随着酶量的增大,酶片活力也随之增加,而在20 U/mL以上时,酶量继续增加,酶片活力却增加的很少。因此,选择固定化酶液浓度为20 U/mL。

  

  

  另外,对戊二醛浓度进行筛选。戊二醛能在温和的条件下与蛋白质的自由氨基反应,交联膜的厚度及戊二醛的含量对传感器的响应具有重要的影响。戊二醛的浓度较低时,蛋白质溶液不会被固定化,而戊二醛的浓度较高又会使酶失活。

  确定AChE的量为100μL后,取30μL 1.0%。的BSA、10 μL浓度分别为1.0%,2.5%,5.0%,10.0%,15.0%,25.0%的戊二醛于0.5 mL的离心管中,旋涡混合器上混匀。将直径为6 mm的硝酸纤维素微孔滤膜片浸入混合酶溶液中,4℃固定8h。固定好后将酶片取出冲洗,常温下干燥后,测定酶活。由图5可知,当戊二醛浓度为1.0%和2.5%时,不足以将胆碱酯酶固定在载体上而使固定化酶片活力低,而当戊二醛浓度高于5.0%时,由于戊二醛是强变性剂能使酶失活,从而使固定化酶片活力损失严重,因此本实验确定戊二醛浓度为5.0%。

  

  

  最后,考察牛血清白蛋白(BSA)浓度的影响。当酶的浓度较低时,加入戊二醛难以发生分子间交联,只形成水溶性低聚物,达不到固定酶的作用,因此需要加入大量惰性蛋白质。最常用的惰性蛋白质是BSA,BSA含有丰富的赖氨酸残基,易与戊二醛作用产生非水溶性的聚合物。依次取100.0μLAChE溶液、浓度分别为0.1%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%各30.0μL的’BSA、10.0μL 5%的戊二醛溶液于0.5 mL的离心管中,旋涡混合器上混匀。将直径为6 mm的硝酸纤维素微孔滤膜片浸入混合酶溶液中,4℃固定8 h。固定好后将酶片取出冲洗,常温下干燥后测酶活性。从图6可以看出,当BSA浓度低时,戊二醛分子直接与酶分子接触,发生剧烈的交联反应,使酶分子失活,而当BSA浓度高时BSA分子的大量存在,由于空间位阻的关系,酶分子不易与底物接触到,导致固定化酶量减小。因此,BSA浓度选择为1.0%。

  

  

  通过上述实验得到最佳固定化酶的条件是:固定化载体为孔径0.45μm硝酸纤维素膜、保护剂牛血清白蛋白(BSA)浓度为1.0%、交联剂戊二醛浓度为5.0%,固定化用酶液浓度为20 U/mL。在最佳固定化条件下进行酶片的制备试验,放入10片活化过的硝酸纤维素滤膜片,4℃固定8 h。同一批次制备的酶片活力数据见表1。

  由表1可知,同一批次固定的酶片活力相近,相对标准偏差为10.61%~14.01%;不同批次固定的酶片活力差别不大,平均活力为1.97~2.09μA。对表1数据进行统计检验,结果表明,数据间不存在显著性差异。说明该固定化方法制备的酶片活力重现性好,方法稳定可靠。

  为了考察固定化酶片的贮存稳定性,将固定化酶片室温下干燥后,4℃保存。每2天测定酶活力,以时间与活力值作图。如图7,固定化酶片在一周内活性损失小于5%,在15天后,仍能保持其80%的活力。说明该方法得到的酶片具有较好的贮存稳定性。

  

  

  3.4 生物传感器法对甲萘威的检测

  首先绘制甲萘威浓度与酶抑制率的关系曲线。将酶片固定在玻碳电极上后,在10.0 mL电解池中加入9.00mL磷酸缓冲液,加入0.50 mL 0.01mol?L-1底物ATChCl,20℃催化反应90 s,进行线性伏安扫描,记录氧化峰电流,此为初始电流值I0。然后相同条件下各加入0.50 mL浓度分别为1000.0,500.0,100.0,50.0,10.0,5.0,1.00,0.10,0.01,0.001 mg?L-1的甲萘威溶液,抑制反应10 min后,加入0.50 mL,0.01 mol?L-1氯化乙酰硫代胆碱,20℃催化反应90 s,线性伏安扫描,记录氧化峰电流,此为抑制电流值I。由抑制率计算公式K=(I0-I)/I0计算出酶的抑制率。

以甲萘威浓度与抑制率的关系作图,如图8

[1] [2]

关键字:甲萘威  硫代  传感器法  醋酸纤维素  浓度  混合酶  缓冲溶液  国家标准法  催化性能

编辑:ssb 引用地址:http://www.eeworld.com.cn/designarticles/sape/200802/article_17788.html
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